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分光光度計原理

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分光光度計原理

發布時間:2013-12-02 瀏覽:3287 次

分光光度計原理
分光光度計是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器。分光光度計是電子引進根據電磁輻射原理,不同的物質具有不同的選擇吸收,也即具有不同的吸收光譜。分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統組成。


許多化學物質具有顏色,有些無顏色的化合物也可以與顯色劑作用,生成有色物質。實踐證明,有色溶液的濃度越大,顏色越深;濃度越小,顏色越淺。因此,可以通過比較溶液顏色深淺的方法來確定有色溶液的濃度,對溶液中所含的物質進行定量分析。基于比較顏色深淺對溶液進行定量分析的方法稱為比色分析法。 


分光光度法是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度,對該物質進行定性和定量分析。常用的波長范圍為:
(1)200~400nm的紫外光區;
(2)400~760nm的可見光區;
(3)2.5~25μm(按波數計為4000cm<-1>~400cm<-1>)的紅外光區。


所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計(或比色計)、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和準確度,所有儀器應按照國家計量檢定規程或本附錄規定,定期進行校正檢定。


包括波長范圍為400~760 nm的可見光區和波長范圍為200~400 nm的紫外光區.不同的光源都有其特有的發射光譜,因此可采用不同的發光體作為儀器的光源.
鎢燈的發射光譜:鎢燈光源所發出的400~760nm波長的光譜光通過三棱鏡折射后,可得到由紅橙,黃綠,藍靛,紫組成的連續色譜;該色譜可作為可見光分光光度計的光源.
氫燈(或氘燈)的發射光譜:氫燈能發出185~400 nm波長的光譜可作為紫外光光度計的光源.
物質的吸收光譜
如果在光源和棱鏡之間放上某種物質的溶液,此時在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現了幾條暗線,即光源發射光譜中某些波長的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜.
不同物質的吸收光譜是不同的.因此根據吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質.
物質的吸收光譜
當光線通過某種物質的溶液時透過的光的強度減弱.因為有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被組成此溶液的物質所吸收只有一部分光可透過溶液.
入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透過光
如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失則:
入射光 = 吸收光 十 透過光


分光光度計采用一個可以產生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而產生特定波長的光源,光線透過測試的樣品后,部分光線被吸收,計算樣品的吸光值,從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
單色光輻射穿過被測物質溶液時,被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比,其關系如下式:
A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc
式中 :A 為吸光度;
I。為入射的單色光強度;
I 為透射的單色光強度;
T 為物質的透射率;
k 為摩爾吸收系數;
L 為被分析物質的光程,即比色皿的邊長
c 為物質的濃度
物質對光的選擇性吸收波長,以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。當已知某純物質在一定條件下的吸收系數后可用同樣條件將該供試品配成溶液,測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區,除某些物質對光有吸收外,很多物質本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多,且常使用單色光純度較差的儀器,故測定時應用標準品或對照品同時操作。


溶液為什么會有顏色,顏色又為什么與濃度有關呢?下面就討論這個問題。
    一、光的互補及有色物質的顯色原理
    1.光的波粒二象性
光是能的一種表現形式,是電磁波的一種。光在真空中以直線方式傳播,在不同的介質處發生反射、折射、衍射、色散、干涉和偏振等現象。可用波長、頻率、傳播速度等參量來描述,即光具有“波動性”。光的顏色即由光的波長決定,人眼能感覺到的光稱為可見光,其波長在400~750nrn之間。在可見光之外是紅外光和紫外光。同時,光也具有“粒子性”,光電效應就是一個很好的例子。光的粒子性理論認為,光是由“光子”(或稱“光量子”)所組成。在輻射能量時,光是以一份一份的能量E的形式輻射的,同時光被吸收時,能量也是一份一份被吸收的。這每一份能量的大小為hυ。光子的能量與波長的關系為E=hυ= hc/λ,式中E為光子的能量(J:焦耳),υ為頻率,h為普朗克常數(6.63×10-34J?S),c為光速,λ為光的波長。因此,不同波長的光,其能量不同,短波能量大,長波能量小。
    2。光的顯色原理
    若把某兩種顏色的光,按一定的強度比例混合,能夠得到白色光,則這兩種顏色的光叫做互補色。圖1中處于直線關系的兩種光為互補色。如綠光和紫光為互補色,黃光和藍光為互補色等等。
各種溶液會呈現出不同的顏色,其原因是溶液中有色質點(分子或離子)選擇性地吸收某種顏色的光。實驗證明:溶液所呈現的顏色是其主要吸收光的互補色。如一束白光通過高錳酸鉀溶液時,綠光大部分被選擇吸收,其它的光透過溶液。從互補色示意圖可以看出,透過光中只剩下紫色光,所以高錳酸鉀溶液呈紫色。
圖1
二、朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律
溶液顏色的深淺與濃度之間的關系可以用吸收定律來描述。它是由朗伯定律和比爾定律相結合而成的,所以叫朗伯-比爾定律。原子吸收分光光度計也符合這個定律。
溶液對光的吸收   當一束強度為I的平行單色光照到溶液時,一部分光被溶液吸收,一部分光被界面散射,其余的光則透過溶液,如圖2所示
圖2
有:I0=Ia+ Ir+ It
I0--入射光強度
Ia--吸收光強度
Ir--反射光強度
It--透射光強度
通常由于Ir很小可忽略不計,上式可簡化為 
I0=Ia+ It
透射光It與入射光強度I0之比為透光率或透光度,用T表示:
T= It/ Ia
透光率的負對數稱為吸光度或光密度或消光度,用A表示:
A=-lgT=lg1/T=lgIa/ It
吸光度越大,表示該物質對光的吸收越強。透光度和吸光度都是用來表示入射光被吸收的程度,它們之間可據式相互換算。
實驗證明,單色光經過有色溶液時,透過溶液的光強度不僅與溶液的濃度有關,而且還與溶液的厚度以及溶液本身對光的吸收性能有關。其規律可用下式表示為A=KCL式中:A(E)——吸光度(或叫做光密度,也可用D表示);K——某溶液的消光(吸收)系數;C——溶液的濃度;L——光程,即溶液的厚度。


   消光系數K是一個常數。一種有色溶液對于一定波長(單色光)的入射光的K值具有一定的數值。若溶液的濃度以摩爾/升表示,溶液厚度以厘米表示,則此時的K值稱為摩爾消光系數。摩爾消光系數是有色化合物的重要特性之一,根據這個數值的大小,可以估計顯色反應的靈敏程度。
   從上式可以看出,當K和L不變時,光密度E與溶液濃度C成正比關系,也可以說,當一束單色入射光經過有色溶液且入射光、消光系數和溶液厚度不變時,吸光度A是隨著溶液濃度而變化的。


   這種單色光與有色溶液的關系稱為朗伯-比爾定律。光電比色計和分光光度計的比色分析方法就是根據這一定律來進行的。但是,朗伯-比爾定律只適用于單色光和低濃度的有色溶液。
    三、朗伯-比爾定律的應用
    1.等吸光度法
    從朗伯-比耳定律可知,當用同一光源照射同一物質的不同濃度溶液時,若吸光度相等,則兩溶液各自的濃度和透光液層厚度的乘積也相等。利用此關系在可見光區用眼作檢測器(目視比色法),即可求出待測溶液的濃度。


   2.計算法
    根據被測溶液濃度的大致范圍,先配制一已知濃度的標準溶液。用同樣的方法處理標準溶液與被測溶液,使其成色后,在同樣的實驗條件下用同一臺儀器分別測定它們的吸光度。
    在標準溶液中:As=KsCsLs
    在待測溶液中:Ax=KxCxLx
    如果測定時選用相同厚度的比色皿使L相等,并使用同一波長的單色光,保持溫度相同,則K也相等。將兩式相除可得As/ Ax=Cs/Cx
    由此可見,在滿足上述條件下,吸光度與溶液成正比。如果設計一種儀器,可以測量吸光度A值,則待測溶液的濃度即可求出 Cx=Ax/ As? Cs
    由于儀器的性能和實驗環境在不斷的變化,所以在采用計算法時,必須每次都要對標準液和被測液進行測量,然后利用上式進行計算,否則會帶來較大的測量誤差。
    由于一般光電比色計在結構上有不少偏離朗伯一比耳定律的地方,故欲得到較準確的結果,常采用標準曲線法。


  3.標準曲線法
    這種方法分以下幾步:
    (1)先配制五種以上標準濃度的溶液。
    (2)測出每種溶液的吸光度A。
(3)做A~C標準曲線圖,如圖3所示。
    有了標準工作曲線便可對溶液進行測量。在同樣的條件下,用儀器測出A后,查標準曲線即可得被測溶液的濃度值Cx。
圖3
由于光電比色計工作在可見光區,只適合在有限個波長下測量,且波長的半寬度大。因此,它不能滿足不同分析工作的需要。其次,光電比色計的靈敏度也低。為了克服以上不足,便發展了性能更好的分析方法:紫外--分光光度法。它利用單色器分光,其單色光純度高,波長范圍寬,并可連續變化,解決了光電比色計存在的問題。

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